中瑞祥分光光度計儀器組成以及原理 儀器組成 分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。 儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。 原理 分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光線透過測試的樣品后,部分光線被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。 單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時,被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比,其關(guān)系如下式: A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc 式中 :A 為吸光度; I0為入射的單色光強度; I 為透射的單色光強度; T 為物質(zhì)的透射率; k 為摩爾吸收系數(shù); L 為被分析物質(zhì)的光程,即比色皿的邊長; c 為物質(zhì)的濃度; 物質(zhì)對光的選擇性吸收波長,以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū),除某些物質(zhì)對光有吸收外,很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多,且常使用單色光純度較差的儀器,故測定時應(yīng)用標準品或?qū)φ掌吠瑫r操作。 常見用途 核酸的定量 核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。 事實上,分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的準確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導致讀數(shù)漂移如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
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